胃泌素通過(guò)其 CCKBR 受體在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮作用。CCKBR 受體在機(jī)體多個(gè)器官或組織都有表達(dá)，包括腎臟、心臟、血管、消化系統(tǒng)等，即使在腸道，其在腸道平滑肌和腸道上皮細(xì)胞都有表達(dá)。而機(jī)體對(duì)鈉吸收的部位是腸道上皮細(xì)胞，為此，我們構(gòu)建小腸上皮細(xì)胞特異性CCKBR受體基因敲除小鼠（CCKBRfl/fl; VillinCre），即該小鼠小腸上皮細(xì)胞內(nèi)的CCKBR受體被敲除，而體內(nèi)其它器官或組織的 CCKBR 受體表達(dá)和功能正常，對(duì)于肝腎等其他組織功能無(wú)影響，更能精準(zhǔn)模擬鈉離子異常吸收導(dǎo)致的高血壓的表型，同時(shí)更好地而模擬人類疾病及并研究相關(guān)機(jī)制和評(píng)價(jià)藥效。

動(dòng)物模型制備過(guò)程中，由由基因工程人員設(shè)計(jì)gRNA靶點(diǎn)及活性檢測(cè)，CCKBRflox/flox小鼠與CCKBRflox/flox,VillinCre的繁育和鑒定均由具有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上崗證的專人完成，飼養(yǎng)人員進(jìn)行日常飼喂，由獸醫(yī)進(jìn)行監(jiān)督管理，造模期間動(dòng)物狀態(tài)良好，病死只數(shù)0，未使用微生物，對(duì)環(huán)境沒(méi)有影響，造模方法可遺傳。

CCKBRfl/fl; Villin Cre小鼠結(jié)果分析

1、生理生化指標(biāo)分析：

2、腸道CCKBR檢測(cè)結(jié)果：

3.小鼠有創(chuàng)及清醒狀態(tài)血壓結(jié)果：

一、模型設(shè)計(jì)原理：

GRNA介導(dǎo)Cas9蛋白剪切目標(biāo)外顯子兩端的內(nèi)含子DNA，同時(shí)提供同源模板Donor，基因組兩端通過(guò)同源重組修復(fù)方式進(jìn)行DNA修復(fù)，在特定外顯子兩端插入FloxP。CCKBR-FloxP小鼠與組織特異性表達(dá)Cre小鼠交配，從而實(shí)現(xiàn)CCKBR基因條件性敲除的目的。實(shí)驗(yàn)采用最新的spCas91.1進(jìn)行注射，減少了基因組中的off-Target。

根據(jù)CCKBR基因組結(jié)構(gòu)和蛋白功能保守區(qū)分析在Exon1的兩邊定點(diǎn)插入FloxP位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)將Exon1條件性敲除。

二、模型設(shè)計(jì)過(guò)程：

1) CCKBR基因GRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及活性檢測(cè)

在要?jiǎng)h除的Exon1外顯子兩端，設(shè)計(jì)gRNA靶點(diǎn)如下：

Cckbr-L1: GCTTAGTTGGAGCTGAGTGGG

Cckbr-L2: TGCTGGAGCTAGCTTAGTTGG

Cckbr-L3: AGCAGGTGGAACCGGTGCTGG

Cckbr-L4: CGCGGGAGCAGGTGGAACCGG

Cckbr-R1: GGACCTAGGTGGGAGCTGAGG

Reverse Complement: CCTCAGCTCCCACCTAGGTCC

Cckbr-R2: GAGGGGAGGGACCTAGGTGGG

Reverse Complement: CCCACCTAGGTCCCTCCCCTC

Cckbr-R3: TTGGAGTCAGGAGAGCTTGGG

Reverse Complement: CCCAAGCTCTCCTGACTCCAA

Cckbr-R4: TGTGAAGGTGTTGGAGTCAGG

Reverse Complement: CCTGACTCCAACACCTTCACA

使用Cas9/gRNA靶點(diǎn)效率檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：VK007）進(jìn)行g(shù)RNA體外活性檢測(cè)，結(jié)果如下：

gRNA靶點(diǎn)活性檢測(cè)結(jié)果分析如下：

2）CCKBRflox/flox,villinCre小鼠設(shè)計(jì)

3）CCKBRflox/flox,villinCre小鼠模型的繁育及鑒定結(jié)果：

CCKBRfloxp/flox小鼠與Cre 的小鼠（villinCre）雜交，對(duì)后代自交獲得的小鼠進(jìn)行基因型鑒定，成功獲得CCKBR腸道上皮細(xì)胞條件性基因敲除小鼠CCKBRflox/flox,villinCre）。見(jiàn)下圖

經(jīng)鑒定12#: CCKBRflox/flox,villinCre

一、疾病概述

高血壓是一種由環(huán)境因素、遺傳因素和行為因素相互作用產(chǎn)生的復(fù)雜心血管癥狀，其中高鹽攝入是最重要的環(huán)境因素之一。所謂血壓的鹽敏感性是指相對(duì)高鹽攝入所引起的血壓升高，它帶來(lái)的危害不僅僅是升高血壓，還能夠引發(fā)腦卒中、心衰、動(dòng)脈粥樣硬化等并發(fā)癥，并可加重胰島素抵抗等。研究表明，鹽敏感性高血壓病人并發(fā)心腦血管事件的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鹽耐受性高血壓病人[2]。西方發(fā)達(dá)國(guó)家一般人群中血壓鹽敏感者約 26%，而原發(fā)性高血壓群體中血壓鹽敏感者約 51%；我國(guó)一般人群中血壓鹽敏感者 20%-30%，而原發(fā)性高血壓群體中血壓鹽敏感者占 50-60%。因此，有效控制鹽敏感性高血壓對(duì)于改善我國(guó)人群健康具有重要的意義。

鹽敏感性高血壓的病理機(jī)制表現(xiàn)為鈉離子吸收增多或者腎臟重吸收異常導(dǎo)致鈉水潴留。目前抗高血壓藥物主要通過(guò)舒張血管和利尿改善鈉水代謝的機(jī)制降低機(jī)體血壓，并且利尿藥物作為臨床用藥的首選藥物，但仍有一定比例的患者沒(méi)能達(dá)到控制目標(biāo)。機(jī)體鈉代謝的調(diào)節(jié)包括機(jī)體通過(guò)消化系統(tǒng)對(duì)鈉的吸收和通過(guò)腎臟對(duì)鈉的排出，目前高血壓治療的臨床藥物和對(duì)高血壓與鈉水代謝的研究主要集中在腎臟對(duì)鈉水代謝的調(diào)節(jié)，而通過(guò)消化系統(tǒng)抑制機(jī)體鈉的吸收可能是從根本上解決鹽敏感性高血壓的重要手段。本動(dòng)物模型將在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，探索胃泌素抑制腸道對(duì)鈉的吸收，及其在調(diào)節(jié)鈉水代謝及鹽敏感性高血壓中的重要作用，為鹽敏感高血壓的防治提供可靠的新模型和行之有效的新思路。

二、模型背景

1、造模因素信息

腸道CCKBR基因條件性敲除小鼠模型

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

C57BL/6小鼠

3、研究背景

胃泌素(Gastrin)是一種重要的胃腸激素，它主要由胃和十二指腸G細(xì)胞分泌產(chǎn)生。胃泌素除調(diào)節(jié)胃腸道的分泌功能外，還能夠?qū)σ认?、小腸、肝臟、腎臟、卵巢等器官有重要的生理調(diào)節(jié)作用[1]。編碼 Gastrin 的基因定位于人類17號(hào)染色體(17q21)上。GWAS分析發(fā)現(xiàn)，胃泌素及其受體 CCKBR（Cholecystokinin B Receptor）所在的遺傳位點(diǎn)與高血壓密切相關(guān)[2,3]。胃泌素受體基因敲除小鼠鈉水代謝障礙，同時(shí)伴有血壓顯著升高[4]。我們首次通過(guò)人群試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高血壓人群餐后胃泌素水平都明顯高于正常人群[5]。胃泌素受體CCKBR基因敲除小鼠（CCKBR-/-）和野生型對(duì)照小鼠，分別給予高鹽飲食（6%NaCl）和正常鹽飲食（0.4% NaCl），發(fā)現(xiàn) CCKBR-/-小鼠高鹽飲食后血壓顯著升高[6]。胃腸道鈉水失衡能夠誘發(fā)多種疾病，如高血壓、心衰和腎病等。已有研究顯示通過(guò)消化系統(tǒng)抑制機(jī)體鈉的吸收可能是從根本上解決鹽敏感性高血壓的重要手段。

我們?cè)O(shè)計(jì)制構(gòu)建的CCKBR基因腸道上皮細(xì)胞特異性敲除小鼠(CCKBRfl/fl;Villin Cre)，通過(guò)正常鹽喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)該小鼠血壓明顯升高，而對(duì)照 CCKBRfl/fl小鼠血壓正常。該模型對(duì)于研究腸道靶向藥物治療鹽敏感性高血壓有研究意義。

參考文獻(xiàn)

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Nat Genet. 2009; 41:527-34.

4. von Schrenck T,Ahrens M, de Weerth A, et al. CCKB/gastrin receptors mediate changes in sodium andpotassium absorption in the isolated perfused rat kidney.

Kidney Int. 2000; 58:995-1003.

5. Jiang X, Wang W, NingB, Yang H, Liu X, Gong J, Gan F, Gao X, Zhang L, Jose PA, Yang Z. Basal andpostprandial serum levels of gastrin in normotensive and

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6. Jiang X, Chen W, Liu X,Wang Z, Liu Y, Felder RA, Gildea JJ, Jose PA, Qin C, Yang Z. Thesynergistic roles of cholecystokinin B and dopamine D5

receptors on theregulation of renal sodium excretion. PLoS One. 2016;11:e0146641